Le roman retrace la naissance extraordinaire de Gargantua, son éducation d'abord confiée à des précepteurs médiévaux inefficaces puis réformée selon les principes humanistes, ses aventures guerrières lors de la « guerre picrocholine », et se conclut par la fondation de l'abbaye de Thélème, communauté utopique dont les membres, libres et bien éduqués, n'ont besoin d'aucune règle contraignante sinon « Fais ce que voudras ». Cette abbaye imaginaire constitue une véritable profession de foi humaniste sur la nature fondamentalement bonne de l'homme libre et cultivé.
Le roman s'impose rapidement comme l'un des textes les plus populaires et les plus discutés de son époque, son mélange de farce et d'érudition humaniste continuant de fasciner les lecteurs et les chercheurs plusieurs siècles après sa parution.
L'épisode de l'abbaye de Thélème reste l'une des utopies les plus célèbres de la littérature occidentale, résumant en une formule — « Fais ce que voudras » — tout un idéal humaniste de liberté individuelle fondée sur l'éducation plutôt que sur la contrainte.